SESIÓN 6

TINCIÓN DE GRAM

1-OBJETIVO:

Realizar la tinción de Gram de una muestra de agua concreta

2-FUNDAMENTO:

Diferenciar mediante la tinción entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram negativa. 

Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (descomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. 

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

3-MATERIAL:

Cubeta de cristal

Puente de tinción

Mechero bunsen

Vaso de precipitado

Pipeta Pasteur x3

Asa de siembra

Portaobjetos

Agua destilada

Papel secante

Reactivos

Lugol

Acetona (30% acetona y 70% Etanol)

Safranina

Cristal violeta

4-PROCEDIMIENTO:

1. Primero se pone una cubeta y sobre el un puente de tinción que es sobre lo que vamos a trabajar, siempre sobre un papel para evitar posibles manchas en la mesa.

2. Cogemos un portaobjetos y en caso de ser un medio espeso sobre el que vamos a hacer la tinción añadimos una gota de solución salina estéril. En caso de ser ya un medio líquido podemos obviar este paso.

3. Tomamos una colonia de la muestra que vamos a tintar y disgregamos por el centro del portaobjetos de forma que quede delimitado en el centro pero bien extendido para evitar grumos o aglomeraciones de células.

4. Secamos el contenido del porta objetos bien al aire o sobre la llama del mechero bunsen teniendo cuidado que no vayamos a quemar de más la muestra, cuando se seque pasamos 4 o 5 veces otra vez la muestra para fijar bien los microorganismos.

5. Empezamos la primera tinción con el cristal violeta durante un minuto para que se impregne lo suficiente del tinte, éste dará color a las Gram positivas.

6. Lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante, es importante lavar por lo menos durante 4 o 5 veces siempre intentado quitar todo el exceso posible de tinte hasta que el porta objetos tenga la zona con la muestra con un tenue color azulado .En nuestro caso usamos agua del grifo porque sabemos que tiene un pH correcto, pero en caso de no serlo usar agua con un pH neutro.

7. Ahora añadiremos Lugol durante un minuto a la muestra, actuara como una “laca” fijando bien el tinte a las células que lo tengan.  

8. Lavar otra vez con agua en exceso para eliminar bien, repetir durante tres o cuatro veces.

9. Ahora procedemos a utilizar el Alcohol-Acetona 7:3, verteremos gota a gota en el portaobjetos inclinado durante unos 40 segundos. Es recomendado 1 minuto pero evita más errores quitarlo un poco antes.

10. Lavar con abundante agua en exceso otra vez, pero en este caso especialmente para asegurarnos que se elimina todo el disolvente, es importante este paso.

11. Por último añadiremos la Safranina, que es el segundo colorante que usaremos o colorante de contraste para darle la tinción a las bacterias Gram negativas. Lo haremos durante un minuto.

12.  Lavar con abundante agua en exceso.

13. Dejaremos secar la preparación para poder ser utilizada en el microscopio.

14. Examinar la composición de la placa al microscopio, pudiendo ir con el revolver de más lejano a cercano o rápidamente con el objetivo 100X y aceite de inmersión.