1-OBJETIVO:
Establecer el número de
microorganismos presentes en un agua muestra mediante método nefelométrico.
2-FUNDAMENTO:
El espectrofotómetro es un
aparato de uso habitual en cualquier laboratorio de tratamiento de aguas. Mide
la densidad óptica, es decir, la absorbancia (luz transmitida a través de una
suspensión). Se debe realizar una curva estándar para relacionar los valores de
absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema.
La cantidad de luz dispersada es
proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda
incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda (λ) cortas.
Se mide el número total de células (vivas y muertas)
Se preparan los tubos
contemplados en dicha tabla, con esas cantidades de sulfúrico y de cloruro de
bario y se rotulan con los números de la izquierda. Se usa para ello pipetas
del volumen adecuado, pipeteador y tubos de ensayo.
3-MATERIAL:
· Tubos de ensayo con tapón
· Pipetas de diferentes
volúmenes
· Espectrofotómetro con
sus respectivas cubetas
· Agua estéril
· H2SO4 0,36M
· BaCl2 0,048M
· Agua Muestra sembrada en
agua peptonada
4-PROCEDIMIENTO:
Lo primero es medir la
absorbancia de los diferentes tubos que hemos preparado de la escala McFarland
y presentarlos en una tabla:
Para el Tubo 0 cogemos sólo
agua estéril para hacer el blanco en el espectrofotómetro.
Hemos cogido sólo cuatro
tubos porque son suficientemente representativos de la escala y además nos da
de sobra para hacer nuestra recta de calibrado.
De esta tabla sacaremos la
siguiente para facilitar el procedimiento matemático:
*En estos datos se ha
obviado la potencia de diez en el número de células, por lo que el resultado final
ha de ser multiplicado por 108.
El procedimiento matemático
que hay que llevar a cabo seguidamente lo adjuntamos en esta foto:
La ecuación pues de
nuestra recta es esta à Y = 0,0461 + 0,069X
Una vez hecho esto,
tenemos que medir la absorbancia de nuestra muestra para trasladarla a la
ecuación.
Para medir la absorbancia
tenemos primero que restarle la turbidez del medio de cultivo a nuestra
muestra. Para ello ponemos en una cubeta agua peptonada estéril y hacemos el
blanco. Seguidamente ya podemos medir la absorbancia de nuestra muestra en agua
peptonada.
La absorbancia de la
muestra medida en el espectrofotómetro es: A = 0,400
Este dato se sustituye en
la ecuación de nuestra recta por la variable Y y despejando X obtenemos el número total de células de nuestra muestra.
Usando la recta anterior y
despejando X, obtenemos que nuestra muestra problema tiene 5,13 · 108 células totales.
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