SESIÓN 10

CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDEZ

1-OBJETIVO:

Establecer el número de microorganismos presentes en un agua muestra mediante método nefelométrico.

2-FUNDAMENTO:

El espectrofotómetro es un aparato de uso habitual en cualquier laboratorio de tratamiento de aguas. Mide la densidad óptica, es decir, la absorbancia (luz transmitida a través de una suspensión). Se debe realizar una curva estándar para relacionar los valores de absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema.

La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta a longitudes de onda (λ) cortas.

Se mide el número total de células (vivas y muertas)

usando la siguiente tabla:

Se preparan los tubos contemplados en dicha tabla, con esas cantidades de sulfúrico y de cloruro de bario y se rotulan con los números de la izquierda. Se usa para ello pipetas del volumen adecuado, pipeteador y tubos de ensayo.

3-MATERIAL:

· Tubos de ensayo con tapón

· Pipetas de diferentes volúmenes

· Espectrofotómetro con sus respectivas cubetas

· Agua estéril

· H₂SO₄  0,36M

· BaCl₂  0,048M

· Agua Muestra sembrada en agua peptonada

4-PROCEDIMIENTO:

Lo primero es medir la absorbancia de los diferentes tubos que hemos preparado de la escala McFarland y presentarlos en una tabla:

Para el Tubo 0 cogemos sólo agua estéril para hacer el blanco en el espectrofotómetro.

Hemos cogido sólo cuatro tubos porque son suficientemente representativos de la escala y además nos da de sobra para hacer nuestra recta de calibrado.

De esta tabla sacaremos la siguiente para facilitar el procedimiento matemático:

*En estos datos se ha obviado la potencia de diez en el número de células, por lo que el resultado final ha de ser multiplicado por 10⁸.

El procedimiento matemático que hay que llevar a cabo seguidamente lo adjuntamos en esta foto:

La ecuación pues de nuestra recta es esta à Y = 0,0461 + 0,069X

Una vez hecho esto, tenemos que medir la absorbancia de nuestra muestra para trasladarla a la ecuación.

Para medir la absorbancia tenemos primero que restarle la turbidez del medio de cultivo a nuestra muestra. Para ello ponemos en una cubeta agua peptonada estéril y hacemos el blanco. Seguidamente ya podemos medir la absorbancia de nuestra muestra en agua peptonada.

La absorbancia de la muestra medida en el espectrofotómetro es: A = 0,400

Este dato se sustituye en la ecuación de nuestra recta por la variable Y y despejando X obtenemos el número total de células de nuestra muestra.

5-RESULTADO:

Usando la recta anterior y despejando X, obtenemos que nuestra muestra problema tiene 5,13 · 10⁸ células totales.

SESIÓN 9

RECUENTO DE ENTEROCOCOS FECALES POR FILTRACIÓN

1-OBJETIVO:

Contar las UFC/ml de enterococos fecales en 100 ml, 50 ml de agua de muestra y 50 ml de agua destilada estéril (1:1), a través de filtración al vacío, en un medio Slanetz-Barnley.

2-FUNDAMENTO:

Es el indicador bacteriológico más eficiente para evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo, debido a que es muy resistente a las condiciones salinas de este medio y además, está relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias, conjuntivitis y dermatitis, entre otras. 

La presencia de Enterococcus faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar contaminación de origen fecal, E. faecalis es considerado como un indicador de contaminación fecal de fuentes humanas, mientras que E. faecium y otras especies indican contaminación de otras fuentes.

3-MATERIAL:

• Vaso de precipitado x3 (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)
• Embudo
• Probeta 100 ml
• Pipeta Pasteur
• Matraz Kitasato
• Alcohol
• Agua Destilada Estéril
• Placa Petri estéril
• Pinzas
• Mechero Bunsen
• Filtro reticulado

4-PROCEDIMIENTO:

Cogemos 50 ml de agua destilada estéril y 50 ml de agua de muestra, vertimos y enrasamos en la probeta con la pipeta Pasteur, y llevamos a 100 ml.

Una vez hecho este paso, procedemos a filtrar al vacío la mezcla.

Preparamos la bomba de vacío, matraz Kitasato y mechero Bunsen. Echamos un poco de alcohol en un vaso de precipitado, agua destilada estéril en una placa Petri estéril y encendemos el mechero. Mojamos las pinzas en alcohol y flameamos rápidamente en el mechero Bunsen. Tomamos el filtro y lo metemos en agua destilada estéril, retirando el papel de filtro reticulado y colocándolo sobre el matraz. Flameamos las pinzas de nuevo y procedemos a verter la mezcla sobre el embudo del matraz y encendemos la bomba de vacío. Una vez filtrado, volvemos a flamear las pinzas y tomamos el filtro reticulado, colocándolo, con cuidado de no dejar burbujas, sobre el medio Slanetz-Barnley. 

Ponemos fecha y nombre de práctica en la placa para identificarla, y metemos en el horno a 40ºC.

5-RESULTADO:

Después de cultivar no ha aparecido ninguna UFC en el medio.

SESIÓN 8

COLIFORMES TOTALES POR FILTRACIÓN

1-OBJETIVO:

Contar las UFC/ml de coliformes totales en 100 ml de muestra, a través de filtración al vacío, en un medio ENDO.

Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes totales en un medio.

Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

2-FUNDAMENTO:

Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo <<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter,Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.

La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli.

Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

- La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.

- La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal.

- Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.

- La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación.

3-MATERIAL:

●      Vaso de precipitado x2 (agua muestra, alcohol)

●      Embudo

●      Probeta 100 ml

●      Pipeta Pasteur

●      Matraz Kitasato

●      Alcohol

●      Placa Petri estéril

●      Pinzas

●      Mechero Bunsen

●      Mechero

●      Filtro reticulado

4-PROCEDIMIENTO:

Cogemos 100 ml de agua de muestra, vertimos y enrasamos en la probeta con la pipeta Pasteur.

Ahora filtramos al vacío el agua de muestra.

(Preparación para la filtración al vacío con el Kitasato): Preparamos la bomba de vacío, matraz Kitasato y mechero Bunsen (mismo procedimiento para las filtraciones). Echamos un poco de alcohol en un vaso de precipitado, agua destilada estéril en una placa Petri estéril y encendemos el mechero. Mojamos las pinzas en alcohol y flameamos rápidamente en el mechero Bunsen. Tomamos el filtro y lo metemos en agua destilada estéril, retirando el papel de filtro reticulado y colocándolo sobre el matraz. Flameamos las pinzas de nuevo y procedemos a verter la mezcla sobre el embudo del matraz y encendemos la bomba de vacío. Una vez filtrado, volvemos a flamear las pinzas y tomamos el filtro reticulado, colocándolo, con cuidado de no dejar burbujas, sobre el medio ENDO 

Ponemos fecha y nombre de práctica en la placa para identificarla, y metemos en el horno a 40ºC


5-RESULTADO:

En este caso hemos contado menos de 30UFC por lo que no sería un resultado representativo de la muestra.

SESIÓN 7

RECUENTO DE SALMONELLA EN PLACA

1-OBJETIVO:

Cultivar salmonella en placa y hacer recuento de la misma.

2-FUNDAMENTO:

El verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

3-MATERIAL:

- Medio Verde Brillante

- Asa de siembra de Digralsky

- Placas de petry

- Alcohol

- Mechero bunsen

- Micropipeta de 1ml

- Vasos de precipitado

- Agua destilada

- 4 Tubos de ensayo

- Mechero

- Gradilla

4-PROCEDIMIENTO:

1- Se ponen en 4 tubos 9 ml de agua destilada

2- Después se realizan una serie de diluciones seriadas a 1:10, en las cuales se coge de la muestra un mililitro, después se echa en el primer tubo, del primer tubo una vez mezclado se coge un mililitro y se echa en el segundo, y así hasta el último.

3- Posteriormente, se le introduce un mililitro, de cada tubo en una placa diferente.

4- Se coge el asa de Digralsky y se reparte uniformemente en la superficie del agar, hasta que se agarra y más tarde se le da le vuelta.

5-CÁLCULOS:

264 colonias tubo 1 -> salmonella (Blanquecinas y pequeñas)

1 colonia       tubo 1 -> E. Coli (Grandes, amarillentas)

UFC/ml = nº colonias x Din (x10)* / Din 1ml    -> *Cambia según el tubo del que se halla realizado(x10 tubo 1, x100 tubo 2, x1000 tubo 3, x10000 tubo 4)

Tubo 1 : UFC/ml= 264 x 10/1= 2640 UFC/ml de salmonella

Tubo 2, 3 ,4 no se cuentan porque son menos de 30 (deben contarse cuando hay entre 30 y 300)

SESIÓN 6

TINCIÓN DE GRAM

1-OBJETIVO:

Realizar la tinción de Gram de una muestra de agua concreta

2-FUNDAMENTO:

Diferenciar mediante la tinción entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativa y Gram negativa. 

Mientras que la pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (descomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. 

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

3-MATERIAL:

Cubeta de cristal

Puente de tinción

Mechero bunsen

Vaso de precipitado

Pipeta Pasteur x3

Asa de siembra

Portaobjetos

Agua destilada

Papel secante

Reactivos

Lugol

Acetona (30% acetona y 70% Etanol)

Safranina

Cristal violeta

4-PROCEDIMIENTO:

1. Primero se pone una cubeta y sobre el un puente de tinción que es sobre lo que vamos a trabajar, siempre sobre un papel para evitar posibles manchas en la mesa.

2. Cogemos un portaobjetos y en caso de ser un medio espeso sobre el que vamos a hacer la tinción añadimos una gota de solución salina estéril. En caso de ser ya un medio líquido podemos obviar este paso.

3. Tomamos una colonia de la muestra que vamos a tintar y disgregamos por el centro del portaobjetos de forma que quede delimitado en el centro pero bien extendido para evitar grumos o aglomeraciones de células.

4. Secamos el contenido del porta objetos bien al aire o sobre la llama del mechero bunsen teniendo cuidado que no vayamos a quemar de más la muestra, cuando se seque pasamos 4 o 5 veces otra vez la muestra para fijar bien los microorganismos.

5. Empezamos la primera tinción con el cristal violeta durante un minuto para que se impregne lo suficiente del tinte, éste dará color a las Gram positivas.

6. Lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante, es importante lavar por lo menos durante 4 o 5 veces siempre intentado quitar todo el exceso posible de tinte hasta que el porta objetos tenga la zona con la muestra con un tenue color azulado .En nuestro caso usamos agua del grifo porque sabemos que tiene un pH correcto, pero en caso de no serlo usar agua con un pH neutro.

7. Ahora añadiremos Lugol durante un minuto a la muestra, actuara como una “laca” fijando bien el tinte a las células que lo tengan.  

8. Lavar otra vez con agua en exceso para eliminar bien, repetir durante tres o cuatro veces.

9. Ahora procedemos a utilizar el Alcohol-Acetona 7:3, verteremos gota a gota en el portaobjetos inclinado durante unos 40 segundos. Es recomendado 1 minuto pero evita más errores quitarlo un poco antes.

10. Lavar con abundante agua en exceso otra vez, pero en este caso especialmente para asegurarnos que se elimina todo el disolvente, es importante este paso.

11. Por último añadiremos la Safranina, que es el segundo colorante que usaremos o colorante de contraste para darle la tinción a las bacterias Gram negativas. Lo haremos durante un minuto.

12.  Lavar con abundante agua en exceso.

13. Dejaremos secar la preparación para poder ser utilizada en el microscopio.

14. Examinar la composición de la placa al microscopio, pudiendo ir con el revolver de más lejano a cercano o rápidamente con el objetivo 100X y aceite de inmersión.