SESIÓN 3

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

*Normas de seguridad:

1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.

2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.

3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).

4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.

8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.

10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.

1-OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es aprender los diferentes métodos de preparación de cultivos y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad.

2-FUNDAMENTO:

Sembrar es introducir una porción de muestra  en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación.

Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

·       Que se efectúen asépticamente

·       Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados

·       Que se realicen solo los manipuleos indispensables

·       Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. Utilizando para ello un mechero bunsen.

3-MATERIAL:

·      Erlenmeyer de 250 ml o botella con tapón de rosca

·      Espátula

·      Vidrio de reloj

·      Agar

·      Peso para pesar la cantidad de agar necesario

·      Placas Petri estériles

·      Microondas

·      Agua destilada

·      Espátulas de Drigalsky

·      Ansa de platino

·      Tubos de ensayo

·      Muestra a analizar

·      Algodón y gasa

·      Agua de peptona

·      Mechero Bunsen

·      Permanente

·      Autoclave

4-PROCEDIMIENTO:

Para la preparación del medio se siguen las instrucciones del rótulo del medio de acuerdo a la cantidad a preparar, haciendo una regla de tres. Se transfiere el medio a un erlenmeyer después de haberlo pesado y ayudándonos de un embudo, una varilla, y el agua destilada establecida. 

Disolvemos los grumos que puedan formarse removiendo la mezcla y la llevamos a ebullición dos o tres veces en el mocroondas.

Se cubre el erlenmeyer con un tapón de algodón envuelto en gasa,con un papel en su interior indicando el tipo de agar utilizado y se cubre con papel albal.

Se esteriliza en el autoclave. Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45ºC. En caso de que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.

Procedimiento de siembra según el tipo de medio:

·   Medio líquido: se sumerge el asa y se agita para que se desprenda el inóculo.

·       Medio semisólido: se siembra en picadura, es decir, se hunde el asa y se retira por el mismo trayecto. Se usa para observar movilidad (crecimiento a ambos lados de la picadura)

·       Medio sólido

-  En tubo con agar horizontal: por picadura

- En tubo con agar inclinado (slant o pico de flauta): se desliza el asa por la superficie dibujando un zigzag desde el fondo hacia la parte superior. En ocasiones se hace en dos tiempos: picadura y zigzag

- En placa: en medio sólido, cada célula viable dará lugar a una colonia (UFC), por lo que se puede llegar a aislar y recontar microorganismos.

§  Siembra por agotamiento en estría: para aislamiento, hay varias técnicas, las más usadas:

a.         Estría simple: se deposita la muestra lo más lejos del operador y se desliza en zigzag. Es importante no volver a sembrar donde ya se ha sembrado.

b.         Estría múltiple: se descarga en 3 o 4 estrías, se esteriliza (si es asa de platino), se enfría, se extiende perpendicularmente esas estrías, se vuelve a esterilizar y se extiende por última vez en estrías anchas por la zona de la placa que queda libre. Es la más usada para aislar colonias.

  

§  Siembra en superficie, en césped o por inundación: para recuentos o antibiogramas. Se añade un volumen conocido con una pipeta estéril en el centro del porta y se extiende con el asa de Digralsky. Según la dilución se podrá contar mejor o peor.

§  Siembra incorporada, en masa o de Barry: se vierte 1 ml de muestra en el centro de una placa y se agregan 20 ml de medio de cultivo fundido y termostatizado a 45º C; se agita la placa. Se usa para recuento de UFC.